Der Einsatz von Restriktionsendonudeasen zur Herstellung rekombinanter DNA

Die Klonierung und gezielte Neukombination von Genen wird durch den Einsatz von Enzymen ermöglicht, die DNA-Moleküle an einer begrenzten Zahl definierter Stellen schneiden. Diese Enzyme werden als Restriktionsendonudeasen (Restriktionsenzyme) bezeichnet.

Der obere Teil von Abbildung 20.2 zeigt schematisch eine Restriktionsschnittstelle eines bestimmten, aus Escherichia coli stammenden Restriktionsenzyms. Die gentechnisch genutzten Endonudeasen erkennen Restriktionsstellen mit einer besonderen Symmetrie in ihren Basenfolgen. In der gewohnten 5' »3'-Rich-

tung gelesen, ist die Nucleotidfolge auf beiden Strängen identisch (palin-

* Natürlich lassen sich aber genauso auch Gene oder andere Genomteile des zur Klonierung eingesetzten Wirtsorganismus selbst auf diese Weise vervielfältigendromisch). Diese Symmetrie ist für die praktische Verwendung dieser Enzyme von höchster Bedeutung. Die meisten Restriktionsenzyme erkennen und binden Sequenzen von vier bis acht Basenpaaren. Da praktisch jede Sequenz dieser Länge in einem sehr langen DNA-Molekül mit hoher Wahrscheinlichkeit rein statistisch mehrfach vorkommt, zerschneidet eine Restriktionsendonudease ein großes DNA-Molekül in zahlreiche Bruchstücke, die als Restriktionsfragmente bezeichnet werden. Identische DNA-Moleküle liefern beim Schneiden mit dem gleichen Restriktionsenzym immer das gleiche, vorhersagbare Restriktionsmuster, das heißt den gleichen Satz von Restriktionsfragmenten.

Die am häufigsten verwendeten Restriktionsenzyme zerschneiden die Zuckerphosphatstränge einer DNA-Doppelhelix in versetzter Weise (Abbildung 20.2). Die so entstehenden Restriktionsfragmente besitzen dann an ihren Enden einen Einzelstrangüberhang, der als kohäsives oder „klebriges" Ende („sticky end") bezeichnet wird.

Die Klonierung eines eukaryotischen Gens in einem bakteriellen Plasmid

Das Ausgangsplasmid wird hier als Klonierungsvektor bezeichnet. Dies ist per Definition ein replikationsfähiges DNA-Molekül, in das Fremd-DNA eingebaut werden kann. Bakterielle Plasmide werden aus mehreren Gründen häufig als Klonierungsvektoren verwendet. Sie lassen sich aus den Bakterien leicht isolieren. In vrfro-Methoden ermöglichen eine gezielte Veränderung der Plasmide, zum Beispiel die Insertion von Fremd-DNA. Anschließend lassen sich die rekombinanten Plasmide auf einfache Weise wieder in Bakterien einschleusen und werden infolge der hohen Teilungsraten ihrer Wirte rasch vermehrt. Schließlich lassen sich Bakterien ohne großen experimentellen und finanziellen Aufwand leicht im Labor züchten (=> Abbildung 20.3).

 
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