Die Gentechnik erlaubt die Untersuchung der Sequenz, der Expression und der Funktion eines Gens

Nachdem wir durch die DNA-Klonierung eine ausreichend große Menge eines bestimmten DNA-Fragments in die Hand bekommen haben, können wir einige interessante Fragen hinsichtlich des betreffenden Gens und seiner Funktion angehen. Unterscheidet sich ein bestimmtes Gen des Menschen von Person zu Person und sind bestimmte Allele des Gens vielleicht mit Erbkrankheiten gekoppelt? Wo und wann wird im Körper ein bestimmtes Gen exprimiert? - Welche Rolle spielt ein bestimmtes Gen für den gesamten Organismus?

Gelelektrophorese und Southern-Blotting

Eine Standardmethode zur Untersuchung von DNA-Molekülen ist die Gelelektrophorese. Wie der Name schon sagt, wird dabei ein Polymergel als Trennmittel in einem elektrischen Feld eingesetzt. Je nach Anwendung werden Aga-rosegele, die aus Polysacchariden bestehen, oder Gele auf Polyacrylamidbasis verwendet. Das Gel wirkt als molekulares Sieb, in dem Nucleinsäure- oder Proteinmoleküle nach ihrer Größe, der elektrischen Ladung oder anderen physikalischen Eigenschaften voneinander getrennt werden (=> Abbildung 20.5). Da Nudeinsäuren unter physiologischen Bedingungen durch ihre Phosphatgruppen negativ geladen sind, wandern sie in einem angelegten elektrischen Feld zum Pluspol (Anode). Bei ihrer Wanderung in der Gelphase behindert die Matrix des Polymergeflechts große Moleküle stärker als kleinere, so dass eine Trennung nach der Molmasse („Moleküllänge'') erfolgt. Ein Gemisch aus linearen DNA-Molekülen wird durch die Gelelektrophorese so in eine Reihe von diskreten „Banden" oder ein diffuses Geschmiere aufgefächert. Durch spezifische Farbstoffe kann die DNA sichtbar gemacht werden und die so erhaltenen Banden enthalten Moleküle gleicher Länge (= Anzahl von Nudeotiden).

Anwendung Die Gelelektrophorese wird regelmäßig eingesetzt, um Makromoleküle wie Nudeinsäuren oder Proteine voneinander zu trennen, die sich in ihrer Größe, der elektrischen Ladung oder einer anderen physikalischen Eigenschaft unterscheiden. In der Restriktionsfragmentanalyse werden geschnittene DNA-Moleküle durch Gelelektrophorese aufgetrennt - dies gilt sowohl für klonierte Gene (Abbildung 20.6) wie fürgenomische DNA (Abbildung 20.7). Technik Das Verfahren der Gelelektrophorese trennt Makromoleküle auf der Grundlage der Wanderungsgeschwindigkeit durch ein Polymergel bei angelegter elektrischer Spannung. Die Strecke, die ein DNA-Molekül dabei zurücklegt, ist umgekehrt proportional zu seiner Länge. Ein Gemisch aus DNA-Molekülen -für gewöhnlich Fragmente, die durch Behandlung mit einem Restriktionsenzym oder durch Amplifikation mittels PCR (siehe oben) erzeugt wurden - wird in eine Abfolge von Banden aufgetrennt. Jede Bande enthält Tausende von Molekülen derselben Länge (Abbildungrechts). Ergebnis Nach dem Abschalten des Stroms wird ein Farbstoff zur Anfärbung der DNA zugesetzt. Dieser Farbstoff fluoresziert im ultravioletten Licht rötlich und lässt die bei der Auftrennung entstandenen Banden aufleuchten. In dem unten zu sehenden Gel sind die fluoreszierenden Banden, die in der Elektrophorese aufgetrennten DNA-Fragmenten entsprechen, deutlich zu erkennen. Falls alle zu sehenden Proben in den unterschiedlichen, nebeneinanderliegenden Bahnen mit dem gleichen Restriktionsenzym behandelt wurden, zeigen die verschiedenen Bandenmuster an, dass sie aus ungleichen Quellen stammen.

Die Gelelektrophorese wird beispielsweise bei der Restriktionsfragmentanalyse eingesetzt. Bei dieser Methode wird die DNA mit Restriktionsenzymen geschnitten und die entstehenden DNA-Fragmente werden elektrophoretisch getrennt. Dabei zeigt sich regelmäßig ein für das Ausgangsmolekül charakteristisches Bandenmuster, das vom eingesetzten Restriktionsenzym abhängig ist. Vergleichsweise kleine DNA-Moleküle, wie die von Viren oder Plasmiden, lassen sich so anhand ihres Restriktionsfragmentmusters durch Vergleich mit einem bekannten Standard zuordnen. Die DNA kann auch aus dem Gel extrahiert werden, so dass die Gelelektrophorese auch zur Reinigung von DNA-Molekülen (zum Beispiel Restriktionsfragmenten, PCR-Produkten und Ähnlichem) eingesetzt wird, sofern sich die Fragmente klar voneinander getrennt haben. (Sehr große DNA-Moleküle wie eukaryotische Chromosomen ergeben bei der Restriktion derartig viele DNA-Fragmente, dass die unzähligen Banden übergangslos ineinander übergehen, so dass sich als Gesamteindruck ein diffuses Geschmier ergibt.)

Die Restriktionsfragmentanalyse wird oft auch zum Vergleich von verschiedenen DNA-Molekülen herangezogen, zum Beispiel der verschiedenen Allele eines Gens. Eine Restriktionsendonudease erkennt, wie wir gelernt haben, eine bestimmte Nudeotid- beziehungsweise Basenfolge. Schon eine Abweichung in einer der Basen ihrer Erkennungssequenz führt zum Ausbleiben der Spaltung. Falls zufällig eine Sequenzvariation zwischen zwei Allelen im Bereich einer Restriktionsschnittstelle auftritt, liefert die Restriktion mit dem betreffenden Enzym bei den Allelen verschiedene Restriktionsbanden (abweichende Restriktionsmuster). Die uns schon begegnete Sichelzellenanämie wird durch eine Mutation eines einzelnen Nucleotids zu Beginn des codierenden Bereichs des /3-Globingens verursacht. Diese Mutation betrifft zufällig eine Restriktionsschnittstelle des Enzyms Odel. Bei der Restriktionsanalyse lässt sich infolgedessen das normale Allel (Wildtypallel) vom Sichelzellenallel unterscheiden (=» Abbildung 20.6).

Ausgangsmaterial für den in Abbildung 20.6 dargestellten Versuch sind klonierte und gereinigte 0-Globinallele. Wie geht man aber vor, wenn keine klonierten Allele zur Verfügung stehen und beispielsweise ermittelt werden soll, ob eine bestimmte Person ein heterozygoter Träger des Sichelzellenallels ist? - Bei der Analyse würde man die DNA-Probe einer gesunden Person (Negativkontrolle) und einer kranken Person (die homozygot für das defekte Allel ist; Positivkontrolle) mit der zu untersuchenden Probe vergleichen. Benutzt man für die Analyse isolierte genomische DNA, so zeigt die Färbung nach der Restriktion und der Gelelektrophorese eine viel zu große Anzahl von Banden, aus der sich die gesuchten Restriktionsfragmente mit dem 0-Globingen nicht abheben. Ein von dem englischen Biochemiker Edwin Southern entwickeltes und nach seinem Erfinder benanntes Verfahren ermöglicht jedoch den Nachweis solcher bestimmter Einzelbanden in komplexen DNA-Gemischen. Dabei bedient man sich einer Kombination aus Restriktion, Gelektrophorese und Nucleinsäurehybridisierung. Das Southern-Blotting wird auch als DNA/ DNA-Hybridisierung bezeichnet. Das Grundprinzip ist das gleiche wie bei der Nucleinsäurehybridisierung zur Durchmusterung von Baktenenklonen. Beim Southern-Blotting wird eine markierte einzelsträngige und zur Zielsequenz komplementäre DNA-Sonde verwendet. Abbildung 20,7 umreißt die experimentelle Vorgehensweise und zeigt, wie sich damit eine heterozygote Person (in diesem Fall der Träger eines Sichelzellenallels) von einem homozygot gesunden Individuum unterscheiden lässt.

Die Identifizierung von Trägern von Mutantenallelen von Erbkrankheiten ist nur eine Anwendung des Southern-Blotting. Tatsächlich ist diese Methode seit ihrer Erfindung Mitte der 70er Jahre des letzten Jahrhunderts ein molekularbiologisches „Arbeitspferd", In vielen Bereichen ist sie jedoch inzwischen von schnelleren Methoden wie der besprochenen Polymerasekettenreaktion (PCR) verdrängt worden. So nutzt man in unserem Beispiel heute in der medizinischen Praxis tatsächlich eine kleine Blutprobe zur Amplifikation des/J-Globin-Genlocus

Die Verwendung der Restriktions-fragmentanalyse zur Unterscheidung zwischen dem normalen 0-Globingen und dem Sichelzellenanämieallel des Menschen,

Abbildung 20.6: Die Verwendung der Restriktions-fragmentanalyse zur Unterscheidung zwischen dem normalen 0-Globingen und dem Sichelzellenanämieallel des Menschen, (a) Die Sichelzellenmutation führt zum Verlust einer der Odel-Restriktionsschnittstellen innerhalb des Gens, (b) Als Folge davon führt die Restriktionsfragmentanalyse mit Odel beim normalen und beim Sichelzellenallel zu unterschiedlichen Fragmenten (abweichenden Bandenmustern).

Anwendung Mit diesem Verfahren kann man spezifische Nucleotidsequenzen innerhalb einer komplex zusammengesetzten DNA-Probe nachweisen. Besonders das Southern-Blotting wird für den Vergleich von Restriktionsfragmenten herangezogen, die aus unterschiedlichen Proben genomi-scher DNA stammen.

Technik In diesem Beispiel werden wir Proben genomi-scher DNA vergleichen, die von drei Personen stammen. Eine ist homozygot für das normale /3-Globinallel (I), eine weitere homozygot für das mutierte Sichelzellenallei (II) und die dritte ist heterozygot (III). Wir setzen eine radioaktiv markierte Sonde ein, doch haben auch bei diesem Verfahren moderne Nachweistechniken die radioaktive Markierung weitgehend verdrängt (siehe Abbildung unten).

Ergebnis Da die Bandenmuster der drei untersuchten Proben deutlich unterschiedlich sind, ist diese Methode geeignet, heterozygote Träger des mutierten Sichelzellenallels (III) ausfindig zu machen, sowie Personen, die beide Mutan-tenallele besitzen (II) und an der Krankheit leiden. Ebenso lassen sich Nichtbetroffene nachweisen, die zwei normale Allele (I) in sich tragen. Das Bandenmuster der Proben I und II ähnelt dem der gereinigten Allele, die wir in Abbildung 20.6b kennengelernt haben. Das Bandenmuster der Probe des heterozygoten Individuums (III) ergibt sich aus der Kombination der Muster der beiden Homozygoten (I und II).

Southern-Blotting (DNA/DNA-Hybridisierung) von DNA-Fragmenten

Abbildung 20.7. Southern-Blotting (DNA/DNA-Hybridisierung) von DNA-Fragmenten.

mithilfe der PCR, schneidet dann die DNA (das PCR-Produkt) mit dem Restriktionsenzym und trennt die erhaltenen Fragmente in einer Gelelektrophorese auf.

 
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